항체가 안 나올 때, 문제는 실험 손이 아니라 고른 항체일 때가 많습니다. 데이터시트의 몇 칸만 먼저 보면 대부분 걸러집니다.
01단클론이냐 다클론이냐
단클론(monoclonal)은 한 종류의 항체가 하나의 에피토프에 붙습니다. 조성이 단순해 정량·재현 실험에 유리한 편입니다. 대신 그 에피토프가 변형·가려지면 신호가 통째로 사라질 수 있습니다. 또 단클론이라는 사실만으로 특이성이나 로트 간 일관성이 보장되지는 않습니다 — 같은 단클론 클론의 두 로트가 서로 반대되는 염색 양상을 보인 사례도 보고돼 있습니다.
다클론(polyclonal)은 여러 에피토프에 동시에 붙습니다. 그래서 조건이 달라져도 검출될 확률이 상대적으로 높지만, 생산 동물·채혈 시점에 따라 조성이 달라 로트 간 편차가 있습니다. 논문 재현에는 클론명이 명시된 단클론이 유리합니다.
02가장 중요한 칸 — 검증된 응용(Applications)
같은 항체라도 응용이 다르면 결과가 갈립니다. 환원·변성 조건의 WB에서는 SDS·가열로 단백질이 펼쳐져 선형 에피토프가 드러납니다. 반면 IHC·IF 시료는 '천연 상태'가 아닙니다 — 포르말린 고정이 인접 분자의 아미노기를 교차결합시켜 에피토프를 가리고, 파라핀 포매 단계에서 한 번 더 가려지므로, 이를 되살리는 항원회수(antigen retrieval) 단계가 따로 필요합니다(위 그림). 그래서 WB만 검증된 항체가 IHC에서 안 나오는 것은 실패가 아니라 예정된 결과일 수 있습니다.
데이터시트에는 응용별로 검증됨(validated)인지, 권장 희석/농도가 얼마인지 적혀 있습니다. 응용마다 희석이 다르므로 그 값을 그대로 출발점으로 삼으십시오. 표적을 없앤 녹아웃 대조에서 신호가 사라지는 것은 강력한 특이성 근거입니다(녹다운은 억제가 불완전해 신호가 남을 수 있으므로 억제 효율을 함께 봅니다). 다만 모든 응용을 아우르는 단일 기준은 없고, 유전학적 방법은 사람 조직·체액 시료에는 쓸 수 없습니다. 독립 항체, 질량분석 같은 직교 검증, 태그 단백질 발현 자료가 함께 실려 있으면 더 좋습니다.
03숙주·아이소타입·반응 종
숙주(host)는 이차항체 선택과 직결됩니다. 예를 들어 마우스 조직에 마우스 유래 일차항체를 쓰면 배경이 심해집니다. 아이소타입(IgG1, IgG2a 등)은 아이소타입 대조와 이차항체 매칭에 필요합니다. 반응 종(reactivity)은 인간·마우스·랫 중 무엇이 실측 확인(confirmed)인지, 아니면 서열로 예측(predicted)인지 구분해서 보십시오 — 예측만 있으면 직접 검증이 필요합니다.
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04포맷·농도·보존제
농도는 희석 계산의 출발점입니다(예: 1 mg/mL). 완충액·carrier(BSA 등)와 보존제도 확인하십시오. 흔한 보존제 아지드화나트륨(sodium azide)은 HRP를 강하게 억제합니다. 항체를 HRP로 직접 접합할 때는 접합 전에 투석·탈염으로 제거해야 하고, HRP 접합 항체 보관액에는 넣지 않습니다. HRP 이차항체를 쓰는 간접 검출이라면 일차항체 원액의 아지드 농도와 실제 희석·세척 조건을 확인하십시오. 독성 물질이라 취급·폐기에도 주의가 필요합니다(보통 0.1 % 미만). 보관 온도는 품번별 데이터시트를 따르십시오. 농축 원액은 2–8 °C에서 한 달 정도 두거나, 장기 보관은 소분해 −20 °C 이하에 두고 반복 동결융해를 피하는 것이 일반 지침입니다. 다만 형광 접합 항체는 얼리지 말고 2–8 °C에 두라는 제조사 안내가 있고, 효소 접합 항체도 동결에 약해 냉장 보관을 권하는 경우가 있습니다.
05살 때 이 순서로 봅니다
- 내 응용(WB/IHC/IF/IP/FACS)이 검증 목록에 있는가, 권장 희석은?
- 내 표적 종이 confirmed인가 predicted인가?
- 정량·재현이면 클론명 있는 단클론, 조건 폭이 넓어야 하면 다클론
- 숙주가 내 샘플·이차항체와 충돌하지 않는가?
- 보존제(아지드)가 내 검출계와 충돌하지 않는가?
참고로, 오사카대학 미생물병연구소 북관에 본사를 둔 일본 기업 BioAcademia(2005년 설립)의 항체 데이터시트에는 숙주·아이소타입·반응 종·권장 희석과 WB·IF 예시 이미지가 함께 실려 있어 위 칸들을 확인하기 쉽습니다. 더랩케미칼은 품목마다 영문 PDF 데이터시트를 함께 제공합니다.